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木質(zhì)纖維素類是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜、性質(zhì)穩(wěn)定的可再生生物質(zhì)資源,占生物質(zhì)總量的40%~50%1。木質(zhì)纖維素類的主要化學(xué)成分為纖維素(40%50%)、半纖維素(25%~30%)和木質(zhì)素(15%20%),這三種成分在共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的作用下構(gòu)成植物細(xì)胞壁的基本骨架,形成天然的“生物質(zhì)抗降解屏障”12)。高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類在當(dāng)今資源緊缺的背景下具有重大意義。纖維素酶作為一種高效催化劑,可以將纖維素轉(zhuǎn)化為纖維二糖和葡萄糖等小分子的可溶性糖,實(shí)現(xiàn)纖維素的高效利用3。酶水解反應(yīng)條件溫和,水解效率高。但是纖維素酶作為一種水溶性制劑,會(huì)與產(chǎn)物融合在一起,

方面導(dǎo)致產(chǎn)物的純度降低,另一方面造成纖維素

酶的流失。同時(shí)纖維素酶對(duì)溫度和pH值等條件敏感。因此纖維素酶的循環(huán)多次利用和提高穩(wěn)定性是主要解決的兩個(gè)問(wèn)題。劉路寬4等人采用介孔分子篩固定纖維素酶,固定率為31.5%,其pH值穩(wěn)定性、穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高。陳偉兵以海藻酸鈉載體,以KH550偶聯(lián)劑,沼氣池固定化酶的米氏常數(shù)與游離酶相比增加了近3倍。米氏常數(shù)的增加表明酶分子其與底物的親和力降低。

本文采用海藻酸鈉-聚乙二醇固定纖維素酶,操作簡(jiǎn)單、固定條件溫和、對(duì)環(huán)境友好。以相對(duì)酶活力和酶活固定率為指標(biāo)對(duì)固定化條件進(jìn)行優(yōu)化,并以相對(duì)酶活力為指標(biāo)對(duì)優(yōu)化后的沼氣池固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,分析固化方法的可行性。

材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料 

纖維素酶購(gòu)自源葉生物,產(chǎn)自綠色木霉,淡黃色  粉未,酶活力為11U,mg,4℃保存。海藻酸鈉購(gòu)  自國(guó)藥集團(tuán),化學(xué)純。聚乙二醇購(gòu)自源葉生物,分子設(shè)4000,化學(xué)純

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1沼氣池固定化酶的制備及優(yōu)化  在3.5%(w/w)的海藻酸鈉溶液中加入聚乙二  醇,混合均勻。取5m3.5%(w/w)海藻酸鈉溶液  與1mL纖維素酶液混合均勻后,加入1%戊二醛作  為交聯(lián)劑,150r·min-振蕩30min。4℃靜置交聯(lián)  4h。將上述交聯(lián)后的溶液通過(guò)5mL注射器加人至  2%(w/w)CaCl2溶液中進(jìn)行固定,形成凝膠小球  更換CaCl2溶液,于4℃下硬化2h。用0.9%(w/w)  NaC溶液洗滌沼氣池固定化酶以去除未被固定的游離酶吸干表面水分,4℃保存  以相對(duì)酶活力和酶活固定率為指標(biāo)對(duì)酶液濃  度、戊二醛用量、固定時(shí)間、固定溫度和聚乙二醇用量進(jìn)行優(yōu)化

1.2.2沼氣池固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析  相對(duì)酶活力為指標(biāo),對(duì)上述優(yōu)化后所制備的  沼氣池固定化酶的最適pH值、最適溫度、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和米氏常數(shù)等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析

1.3分析方法

還原糖, CMC-Na酶活:DNS法  酶活固定率按公式(1)計(jì)算  酶活固定率(%)

沼氣池固定化酶的酶活力  固定體系中的游離酶的總酶活五×100(1)2.結(jié)果與討論

2.2海藻酸鈉沼氣池固定化酶條件優(yōu)化

2.1加酶量對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響

酶量對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響見(jiàn)圖1。將最大酶活力設(shè)定為100%。加酶量由2.5mg·mL增加至12.5mg·mL,沼氣池固定化酶的相對(duì)酶活力隨之增加,由53%增加至100%。隨著載體所固定的酶分子量的增加,二者之間的結(jié)合位點(diǎn)逐步接近飽和,因此當(dāng)酶液濃度為10mg·m時(shí),沼氣池固定化酶的酶活力達(dá)到99%,進(jìn)一步增加酶液濃度,酶活力增加不明顯。由于載體與酶分子之間的結(jié)合位點(diǎn)有限因此盡管在固定體系中加大酶液濃度使得被固定的

酶分子量增加,但是大部分酶分子會(huì)以游離態(tài)的形  式損失掉M,因此酶活固定率隨著給酶量的增加而  逐步降低,由69%降至25%。綜合考慮加酶量對(duì)固  定化酶相對(duì)酶活力和酶活固定率的影響,選擇酶液濃度為5.0mg·mL用于后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.2交聯(lián)劑用量對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響  交

聯(lián)劑用量對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響見(jiàn)圖2。將  最大酶活力設(shè)定為100%。交聯(lián)劑采用1%(w/w  戊二醛。隨著戊二醛用量的增加,沼氣池固定化酶的相對(duì)  酶活力和酶活固定率的變化趨勢(shì)基本一致,呈現(xiàn)出先  增加而后降低的趨勢(shì)。戊二醛作為交聯(lián)劑,含有的兩個(gè)醛基官能團(tuán),可以與纖維素酶中的氨基發(fā)生Sch交聯(lián)反應(yīng)”。隨著戊二醛用量的增加,酶分子之間交聯(lián)度增加,在一定程度上可以減少由于酶分子粒徑過(guò)小而導(dǎo)致的酶流失,提高其固定率。但是當(dāng)交聯(lián)劑的用量過(guò)大,會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的交聯(lián)度過(guò)大,使得酶分子的活性中心受到破壞,酶活力降低。當(dāng)在海藻酸鈉:戊二醛(vv)大于1:0.3時(shí),沼氣池固定化酶的相對(duì)酶活力和酶活固定率不再增加。因此選擇海藻酸鈉:戊二醛(vv)為1:0.3用于后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.3固定化時(shí)間對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響

固定化時(shí)間對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響見(jiàn)圖3。將最大酶活力設(shè)定為10%。沼氣池固定化酶的相對(duì)酶活力

和酶活固定率隨固定化時(shí)間的變化趨勢(shì)一致,呈現(xiàn)先增加后減低的趨勢(shì)。當(dāng)固定化時(shí)間為25h時(shí),沼氣池固定化酶的相對(duì)酶活力和酶活固定率均達(dá)到最大值。

固定化的過(guò)程是海藻酸鈉的α-L-古羅糖醛酸(G單元)的Na與CaCl2的Ca2+由外在內(nèi)發(fā)生離子交換反應(yīng)的過(guò)程。G單元中的2OH和5-C00H通過(guò)配位鍵與Ca2形成“eg-box”結(jié)構(gòu),生成凝膠將酶分子包埋固定10。隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng),離子交聯(lián)反應(yīng)更為充分,載體結(jié)構(gòu)更為致密,可以減少在固定過(guò)程中由于載體表面和內(nèi)部的孔徑過(guò)大造成的酶分子流失。同時(shí)凝膠強(qiáng)度與Ca2含量呈正相關(guān),可以對(duì)酶分子的活性起到保護(hù)作用。并且Ca2也是纖維素酶的激活劑,可以提高纖維素酶的活力2)。但是當(dāng)固定化時(shí)間大于2.5h后,隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),載體表面的孔徑結(jié)構(gòu)過(guò)于致密,在定程度上會(huì)阻礙底物進(jìn)入至載體內(nèi)部與酶分子充分地接觸,傳質(zhì)阻力增加,使得纖維素酶的酶活力降低。因此固定時(shí)間為2.5h用于后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.4固定化溫度對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響

固定化溫度對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響見(jiàn)圖4。將最大酶活力設(shè)定為100%。隨著固定化溫度的增加,相對(duì)酶活力和酶活力均呈現(xiàn)出先增加后降低的

趨勢(shì)。當(dāng)固定化溫度為50℃時(shí),相對(duì)酶活力和酶活固定率均達(dá)到最大值。隨著固定化溫度的增加,可以加速海藻酸鈉與CaCl2進(jìn)行離子反應(yīng),在一定的固定化時(shí)間內(nèi),使載體的結(jié)構(gòu)更為致密,提高酶分子的固定率。但是載體一旦過(guò)于致密,會(huì)增加底物的擴(kuò)散系數(shù),使得纖維素酶的酶活力降低。同時(shí)纖維素酶的活性與溫度有關(guān),溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的活性中心位點(diǎn)受到影響,從而使酶分子的活力降低;當(dāng)溫度高于50℃時(shí),酶分子的失活率大于酶分子的固定率,在綜合作用下,使得纖維素酶的酶活力降低。因此選擇固定溫度為50℃用于后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。2.2.5聚乙二醇用量對(duì)沼氣池固定化酶的效果影響

聚乙二醇用量對(duì)沼氣池固定化酶效果的影響見(jiàn)圖5。將最大酶活力設(shè)定為100%。沼氣池固定化酶的相對(duì)酶活力和酶活固定率隨聚乙二醇用量的增加,二者均呈現(xiàn)為先增加后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)海藻酸鈉:聚乙二醇為1:1.5(w:w)時(shí),沼氣池固定化酶的相對(duì)酶活力和酶活固定率均達(dá)到最大值,并且與未添加聚乙二醇的沼氣池固定化酶相比,添加聚乙二醇可以提高酶活力和酶活固定率分別為25%和18%

聚乙二醇用作致孔劑的原理為其可以在海藻酸鈉與Ca2+交聯(lián)時(shí)從固定化體系中溶出,增加載體的孔密度。同時(shí)聚乙二醇含有的聚乙二醇基和羥基均可以與載體和酶分子形成氫鍵,增加沼氣池固定化酶的親水性,提高酶活力13。隨著聚乙二醇用量的進(jìn)一步提高,當(dāng)海藻酸鈉:聚乙二醇(w:w)大于1:1.5后,載體表面及內(nèi)部的孔密度過(guò)大,會(huì)造成酶分子的流失,因此沼氣池固定化酶的酶活力和酶活固定率均降低。2.3沼氣池固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)比分析

2.3.1pH值對(duì)沼氣池固定化酶和游離酶酶活力的影響

參△pH值對(duì)沼氣池固定化酶和游離酶酶活力的影響見(jiàn)6。  大酶活力設(shè)定為100%。pH值會(huì)影響底物和酶分子的解離和絡(luò)合、影響纖維素酶的活性中心分

子構(gòu)象,從而影響酶分子穩(wěn)定性,因此過(guò)高或者過(guò)低的pH值會(huì)使纖維素酶的活性降低。其中,游離酶的最佳pH值為4,沼氣池固定化酶的最佳pH值為5,比游離酶的最佳pH值增加了一個(gè)單位。這種原因可能是由于海藻酸鈉在反應(yīng)體系中具有大量的羧基官能團(tuán),可以與H“結(jié)合生成羧酸,載體周圍聚集大量的H,使得反應(yīng)體系較游離酶的反應(yīng)體系相比向酸性移動(dòng),因此為了維持酶分子的最佳pH值使得沼氣池固定化酶的表觀pH值向堿性方向移動(dòng)。

2.3.2溫度對(duì)沼氣池固定化酶和游離酶酶活力的影響

溫度對(duì)沼氣池固定化酶和游離酶酶活力的影響見(jiàn)圖7。將最大酶活力設(shè)定為100%。在溫度為30℃80℃的變化范圍內(nèi),沼氣池固定化酶和游離酶的酶活力均為先增加后降低的變化趨勢(shì)。原因是在酶催化反應(yīng)過(guò)程中,升高反應(yīng)體系的溫度,一方面可以提高底物和酶分子的分子動(dòng)能,有助于加速二者的吸附解離和絡(luò)合,改變反應(yīng)的平衡常數(shù)從而加速酶促反應(yīng)的進(jìn)行;而另一方纖維素酶自身的活性位點(diǎn)會(huì)受到溫度的影響,其活性會(huì)隨著溫度的升高而降低甚至失活,最適溫度是兩方面綜合作用的結(jié)果。

游離酶的最適溫度為50℃,沼氣池固定化酶的最適溫度為70℃,與游離酶相比,沼氣池固定化酶的最適溫度增加了20℃。因?yàn)槔w維素酶經(jīng)過(guò)交聯(lián)固定后,一方面酶分子運(yùn)動(dòng)和伸展受到限制,因此其活性中心的穩(wěn)

定性增加,而另一方面載體可以阻擋過(guò)高的溫度對(duì)酶分子的影響。  2.3.3沼氣池固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性分析

沼氣池固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性分析見(jiàn)圖8。將最大酶活力設(shè)定為100%。沼氣池固定化酶和游離酶在0℃~80℃下保溫2h,沼氣池固定化酶和游離酶的酶活力有不同程度的降低。

當(dāng)溫度低于40℃時(shí),游離酶的活力沒(méi)有明顯變化,相對(duì)酶活力保持在100%,由40℃升高至60℃時(shí),游離酶的相對(duì)酶活力迅速降至39%,進(jìn)一步升高至80℃,相對(duì)酶活力變化不明顯,穩(wěn)定在33%以上。

當(dāng)溫度低于60℃時(shí),沼氣池固定化酶的相對(duì)酶活力保持超過(guò)98%,酶活力沒(méi)有明顯的變化。當(dāng)溫度高于60℃之后,沼氣池固定化酶的酶活力降低較為明顯。因?yàn)槔w維素酶經(jīng)過(guò)交聯(lián)固定后,一方面酶分子的空間構(gòu)  型更為穩(wěn)定、活性中心得到保護(hù),另一方面載體可以  阻擋高溫等不利因素對(duì)酶分子的直接接觸,從而使  沼氣池固定化酶的熱穩(wěn)定性提高。并且當(dāng)溫度高于固  定化酶和游離酶自身的最適溫度后,酶活力降低明  顯。可能是因?yàn)榈陀谧钸m溫度的保溫,溫度可以使  酶分子提前預(yù)熱用于后續(xù)酶水解反應(yīng),溫度高于最  適溫度后,保溫使得酶分子的活性位點(diǎn)和空間構(gòu)型  受到不可逆的影響,使其發(fā)生熱變性

2.3.4沼氣池固定化酶的操作穩(wěn)定性分機(jī)  

沼氣池固定化酶的操作穩(wěn)定性分析見(jiàn)表1。將最大酶  活力設(shè)定為100%。在初次使用過(guò)后,會(huì)有部分未  被載體完全固定的淺層游離態(tài)的酶分子流失,從而  導(dǎo)致酶活力大幅度降低。并且在重復(fù)使用的過(guò)程  中,反應(yīng)體系的pH值和溫度等因素會(huì)對(duì)載體和酶  分子的穩(wěn)定性造成影響,可能導(dǎo)致酶分子泄露以及酶活性降低。

2.3.5沼氣池固定化酶和游離酶的K

對(duì)比分析沼氣池固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)K。擬合曲線圖9和圖10所示。沼氣池固定化酶和游離酶的K。分別為

1.850mg·mL和0.809mg:mL-1。較游離酶相比,沼氣池固定化酶的K增加了125%,說(shuō)明沼氣池固定化酶與底物之間的親和力降低。原因一方面是因?yàn)槊阜肿颖还潭ㄔ谳d體內(nèi)部,與底物的接觸受限,降低了底物和酶分子之間的親和力;另一方面是纖維素酶經(jīng)過(guò)交聯(lián)劑的交聯(lián),空間構(gòu)象和活性中心可能發(fā)生改變,導(dǎo)致K。增加14。

3結(jié)論

(1)綜合考慮相對(duì)酶活力和酶活固定率,海藻酸鈉聚乙二醇沼氣池固定化酶的制備條件為:酶液濃度=5mg·mL,交聯(lián)劑采用1%(w/w)戊二醛,海藻酸鈉戊二醛=1:0.3(v:v),海藻酸鈉:聚乙二醇=1:1.5(w:w),固定溫度和時(shí)間分別為50℃和2.5ho

(2)與游離酶相比,沼氣池固定化酶的最適pH值向堿性方向移動(dòng),最適溫度提高20℃,熱穩(wěn)定性提高,米氏常數(shù)提高1倍。循環(huán)水解利用3次后,仍可保留50%的酶活力。說(shuō)明此固定方法可以有效的將纖維素酶固定,并且酶學(xué)性質(zhì)較游離酶大幅度提升。

摘自《中國(guó)沼氣》2018第二期 馬一方 蘭森 劉研萍 李秀金

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